鼠骨髓中性粒細胞分離液 KIT 說明書
 
【產(chǎn)品規(guī)格】
 
200ml/Kit
 
【產(chǎn)品組成】
 
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
 

	名稱	產(chǎn)品編號	規(guī)格
A	分離液 1		200ml
B	樣本稀釋液	2010C1119	200ml
C	清洗液（贈品）	2010X1118	200ml
D	紅細胞裂解液（贈品）	NH4CL2009	100ml
E	紅細胞沉降液（6%羥乙基淀粉）	HES-TBD550-80	80ml
F	試劑 F	F2013TBD	200ml
G	說明書		1 份

 
【實驗前準備】
 
適用儀器：最大離心力可達 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機
 
【檢驗方法】
 
全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。
 

• 首先制備骨髓單細胞懸液，制備方法詳見“鼠骨髓沖洗單細胞懸液制備技術(shù)”。

 

• 取一支 15ml 離心管，先加入分離液 1：3ml，后加入 80%濃度分離液 1 溶液（分離液 1：

 
樣本稀釋液=4：1 的混合液）：1.5ml，形成梯度界面。
 

• 用吸管小心吸取細胞懸液樣本加于分離液之液面上，650-800g ，離心 20-30min（注：如改變樣本及分離液用量，需相應(yīng)調(diào)整離心力及離心時間，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果）。

 

• 離心后，稀釋液層下出現(xiàn)兩層白色環(huán)狀細胞層，取下層白色環(huán)狀中性粒細胞層（會有少量紅細胞混雜），加 3-5 倍體積清洗液混勻，400g 離心 10min。

 

• 離心后棄上清，后可通過兩種方法去除紅細胞。

 
方法一：細胞沉淀用紅細胞裂解液去除紅細胞（具體方法參見“紅細胞裂解液說明書”）。
 
方法二：
 
1.  細胞沉淀用 1ml 紅細胞沉降液重懸，加于 3ml 分離液 1 之液面上，400g 離心 20min。
 

• 取白色環(huán)狀細胞層，加 3-5 倍體積清洗液混勻，250g 離心 10min，重復洗滌 2-3 次，獲得目的細胞（如仍有少量紅細胞混雜，使用紅細胞裂解液去除紅細胞）。

 
分離圖例
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
【注意事項】
 

• 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得最佳的實驗結(jié)果，需在取樣 2h 內(nèi)進行實驗。

 

• 本實驗最好不使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細胞分離效果。

 

• 分離液用量大于骨髓單細胞懸液樣本量時，分離效果更佳。

 

• 如實驗后細胞得率或活性過低，請聯(lián)系技術(shù)支持以尋求幫助.

 

• 請勿使用具有紅細胞保護成分的抗凝劑，否則影響分離效果（離心后，紅細胞不能完全沉至離心管底部）。

 
【儲存條件及有效期】
 
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
 
【參考值（參考范圍）】
 
本實驗中性粒細胞提取率大于 80%。
 
【相關(guān)實驗技術(shù)方案】

• 骨髓沖洗單細胞懸液制備技術(shù)。

 

• 所獲得中性粒細胞的培養(yǎng)技術(shù)。

 

• 所獲得中性粒細胞的核酸提取技術(shù)。

 

• 所獲得中性粒細胞的鑒定方法A.流式細胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)

 
C.原位雜交技術(shù)
 
D.PCR 技術(shù)
 
【可能存在的問題及解決方法】
 
1. 由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
 

出現(xiàn)情況	出現(xiàn)原因	建議解決方案
離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層	轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短	適當增減轉(zhuǎn)速
離心后目的細胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長
離心后白環(huán)層彌散	細胞密度過大	調(diào)整細胞密度
離心后白環(huán)層太淺或看不見	細胞密度過小

 

• 本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當?shù)厍闆r對離心條件進行適當調(diào)整。建議對離心條件進行調(diào)整時，恒定離心時間，對離心轉(zhuǎn)速進行調(diào)整。

 

• 本分離液依照國際標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細胞沉降不完全的情況，可以適當加大離心轉(zhuǎn)速。

 
注：在對離心條件進行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達到最佳分離效果，
 
離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準。